Công nghệ sinh học thực vật

I. Mở đầu

Nuôi cấy mô thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Bằng các kỹ thuật nuôi cấy trong điều kiện vô trùng các bộ phận tách rời của cơ thể thực vật, người ta đã nhân giống in vitro thành cô...

II. Nuôi cấy mô và nhân giống in vitro

1. Thuật ngữ học (terminology)

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất ...

1.1. Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem-tip culture)

Phương thức nhân giống bằng cách dùng các phận rất nhỏ của đỉnh chồi (shoot-tip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) và mầm lá non (young leaf primordia) để kéo dài chồi (shoot elongation) ngay sau đó. Kiểu nuôi cấy này được dùng lần đầu tiên để làm sạch virus (virus-free) ở thực vật. Nếu dùng đỉnh phân sinh không thể sống sót và tạo rễ một cách độc lập, thì có thể thay thế bằng phương thức vi ghép (micrografting).Thành công điển hình trong phương thức này là nhân giống các cây một lá mầm như hoa lan, dứa, huệ và chuối (protocorm hoặc cụm chồi)... hoặc cây hai lá mầm như khoai tây, cà chua và cúc (kéo dài chồi)...

1.2. Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation)

Kiểu nuôi cấy này sử dụng chồi của các điểm sinh trưởng bên và ngọn nơi mà sự kéo dài của chồi ngọn (elongation of terminal shoot) bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh. Sự điều khiển này cho phép nhân nhanh được các chồi in vitro (microshoots), là các chồi có thể tách ra và tạo rễ in vitro để hình thành cây trong ống nghiệm (microplants), hoặc nó có thể được cắt ra riêng biệt tạo thành các cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên ngoài in vitro.Phương thức này thường được áp dụng cho các đối tượng hai lá mầm như cúc, cà chua, thuốc lá...

1.3. Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction)

Loại nuôi cấy cho phép hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới. Một số loại mẫu vật được dùng như là đoạn thân (thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải), mảnh lá (thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao), cuống lá (thủy tiên), các bộ phận của hoa (súp lơ, lúa mì, thuốc lá), nhánh củ (họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên), đoạn mầm (măng tây)...

1.4. Phát sinh cơ quan (organogenesis)

Thuật ngữ này dùng để mô tả quá trình tái sinh các chồi hoặc/và rễ bất định từ các khối tế bào callus. Quá trình này xảy ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng tạo callus. Đối với mục đích nhân giống in vitro...

1.5. Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis)

Thuật ngữ này dùng cho sự phát triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh dưỡng được sản xuất từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro. Thuật ngữ tương đương đối với sự phát triển phôi ở thực vật sinh trưởng trong điều kiện...

2. Nhân giống in vitro và các hệ thống nuôi cấy mô

Phương pháp nhân giống in vitro thực chất là một tiến bộ vượt bậc của các phương pháp nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, giâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… Ở đây giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học kỹ thuật là đã biến những phương thức cổ đ...

2.1. Tái sinh cây mới từ các cấu trúc sinh dưỡng

2.1.1. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh

Phương thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi (shoot-tip) hay đỉnh sinh trưởng (apex) làm mẫu vật nuôi cấy. Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh (apical meristem) và các mầm lá non (young leaf primordia). Khái niệm mô phân sinh đỉnh (ngọn) chỉ đú...

2.1.2. Nuôi cấy chồi bất định (adventitious shoot culture)

Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới. Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô...

2.2. Nhân giống thông qua giai đoạn callus

Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus. (Hình 4.5)Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông qua giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus như trường hợp của Kehr và Sehaffer (1976) thu được ở tỏi.

2.3. Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính - công nghệ phôi vô tính

2.3.1. Phôi vô tính

Một phương thức nhân giống vô tính nữa là tạo phôi vô tính từ tế bào mô sẹo. Năm 1958, Street và Reinert là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota). Đến năm 1977, Murashige cho rằng phôi vô t...

2.3.2. Công nghệ hạt nhân tạo

Hạt nhân tạo (artificial seed hoặc synthetic seed) là phôi vô tính bọc trong một lớp vỏ polymer như agar, agarose, alginate… Trong cấu trúc lưới của các lớp vỏ đó, nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô...

2.3.3. Nhân giống trong các nồi phản ứng sinh học

Trước đây, các nồi phản ứng sinh học hay còn gọi là nồi lên men (fermentor) chủ yếu được dùng cho công nghệ vi sinh. Trên cơ sở các thiết bị đó, với một số cải tiến, nhiều tác giả đã nhân giống thành công nhiều loại phôi vô tính và các thể chồi, cụm ch...

3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

Quy trình nhân giống vô tính in vitro được thực hiện theo 3 (hoặc 4-tùy theo cách phân chia của từng tác giả) giai đoạn:- Cấy gây- Nhân nhanh- Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

3.1. Giai đoạn I - cấy gây

Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau:- Tỷ lệ nhiễm thấp.- Tỷ lệ sống cao.- Tốc độ sinh trưởng nhanh.Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu. Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ…Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh.Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:- Muối khoáng: Theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962).- Chất hữu cơ:+ Đường saccharose 1-6 %.+ Vitamin: B1, B6, myo-inositol, nicotinic acid.+ Acid amin: Arg, Asp, Asp-NH2, Glu, Glu-NH2, Tyr.+ Phytohormone: Theo nhập môn công nghệ sinh học củaNguyễn Hoàng Lộc